Biokémiai praktikum

Összefoglaló gyüjtemény a proteinek biológiai folyamatokban játszott szerepéről. Modern kutatási módszerek áttenkinthető tárháza már a a elméleti alapokkal rendelkező olvasók számára is.Kísérletek melyek lehetővé teszik az alapszintű elsajátítását a gyákorlati munkának is, kezdő kutatók és a felsőoktatási intézmények hallgatatóinak.

I. Fehérjék 9

Bevezetés 9
A fehérjék tisztítása 10
A fehérjék elvásztása méretük alapján
 nem etektroforetikus módszerek) 10
Szelektív kicsapások 13
Elektromos töltéskülönbségek alapján történő elválasztás 15
Specifikus kötőképesség alapján történő elválasztás 6
Adszorpciós különbségek alapján történő elválasztás 7
A fehérje tisztításának kővetése 17
A fehérje tisztaságának bizonyítása 17
Fehérjék és peptidek hidrolízise 18
Fehérjék aminosavsorrendjének meghatározása (szekvenálás) 18
Fehérjeoldatok tu’ajdonságainak vizsgálata (1. kísérlet) 21
Dializis (2. kísérlet) 22
Fehérje kimutatása indikátorfestékkel (3. kísérlet) 23
Fehéijék gélszűrése (4. kísérlet) 24
Komplex I és komplex III affinitáskromatográfíás izoálása
Cibacron Blue 3GA Agarose osztopon (5. kísérlet) 25
Kation- és anioncserélő kromatográfla (6. kísérlet) 28
Aminosavak elválasztása ioncserélő vékonyréteg-kromatográflával
(7. kíséret) 28
Fotometriás koncentrációmérés elve 31
Fotometriás mérés gyakorlati kivitelezése 32
Fehérjemeghatározás ultraibolya fényelnyelés alapján 34
Fehérjemeghatározás biuretreakcióval (8. kísérlet) 35
Fehérjemeghatározás Lowry szerint (9. kísérlet) 38
Fehérjék azonosítására alkalmas módszerek 39
Elektroforetikus eljárások 39
Poliakrilamid-géklektroforézis (10. kísérlet) 43
Elektroforézis kombinálása immunológiai módszerekkel 45
A Western-blot 45
ADot-blot 47
\Vestern-hlot (II. kísérlet) 47

II. Enzimek 50
Az enzimaktivitás mérése és egységei 50
Az enzimaktívitás mérésének feltételei 52
Enzimhatás bizonyítása és enzimaktivitás mérése (2. kísérlet) 53
Szubsztrátkoncentráció hatása az ertzimaktivitásra 54
Szubsztrátkoncentráció hatása az enzimreakció sebességére,
a KM meghatározása (13. kísérlet) 59
Enzimgátlások 60
Enzimgátlások szemléltetése (14. kísérlet) 63
SH-csoportot tartalmazó enzimek, az SH-csoport reakeiói 65
Fehérjében levő SH-csoport meghatározása (15. kísérlet) 68
SH-enzímek vizsgálata az ureáz példáján (16. kísértet) 69
A Warburg-féte optikai teszt 70
Laktátdehidrogenáz aktivitásának meghatározása optikai teszttel
(17. kísértet) 73
Enzimek szöveti eloszlása (8. kísérlet) 74
Enzimatikus analízis 78
A glukóz és galaktóz együttes meghatározása enzimatikus és kémiai
analízissel (19. kísérlet) 80
A karnítin-acetiltranszferáz (CAT) enzimaktivitásának mérése
és minta karnitintartalmának meghatározása (20. kísértet) 85
Piruvát enzimatikus meghatározása (21. kísérlet) 86
III. Energiatermelő folyamatok 89
A fermentáció anorganikus foszfátszükséglete (22. kísértet) 89
Szukcinátdehidrogenáz aktivitásának mérése és kompetitív gátlása
(23. kísérlet) 92
Gázanyagcsere mérése Warburg-féle manometriás módszerrel 94
Az étesztő anyagcseréjének mérése Warburg-módszerrel
(24. kísérlet) 96
Oxigénfogyasztás mérése Ctark-eektródda1 (25. kísérlet) 98
Multienzimkompiexek 103
A piruvát-dehidrogenáz enzimkomplex vizsgálata (26. kísértet) 05
Karnitin és karnitin-aciltranszferáz 106
A karnitin-acetiltranszferáz aktivitásának mérése (27. kísérlet) 107
A vizelet szabad- és összkarnitin tartalmának a meghatározása
(28. kísérlet) t09
ATP, ADP és AMP mennyiségének mérése HPLCvel.
Az „Energy charge” számítása (29. kísértet) 110
IV. Intermedier anyagcsere 114
Lipidek vizsgálómódszerei 114
Szabad zsírsavak mennyiségi meghatározása 115


Trigticeridek mennyiségének meghatározása 115
Foszfolipidek kímutatása, meghatározása 115
Zsírsavösszetétel meghatározása 115
Szteroidok kímutatása 116
Zsírsavak elválasztása gázkromatográfiával (30. kísérlet) 116
Gázkromatográfiás tömegspektrométer (GC-MS) 120
A gázkromatográfiás tömegspektrométer felépítése 120
Mono- és dikarbonsavak metilészter-származékainak szétválasztása
és meghatározása GC-MS segítségével (31. kísérlet) 123
Az intenzív folyadékkromatográfia (HPLC) 124
C-vitamin meghatározása HPLC-vel (32. kísérlet) 126
Koleszterin meghatározása (33. kísérlet) 128
Koleszterin kinnitatása (34. kísérlet) 130
Izolált máj perfúziója 130
Szérumenzimek vizsgálata 132
GlutamInsav-oxálecetsav-transzamInáz meghatározása kapcsolt optikai teszttel (35. kísérlet) 134
Kolinészteráz vizsgálata (36. kísérlet) 136
Lipáz vizsgálata (37. kísérlet) 139

Genetikai információk 141
A plazmidok restrikciós térképezése 141
A pBR 322 plazmid emésztése restrikciós enzimekkel
(38. kísérlet) 143
A DNS elektroforézise agarózgélen (39. kísérlet) 144
Génexpresszió szabályozása 145
Citrátszintáz expressziójának vizsgálata (40. kísérlet) 146
Polimeráz-láncreakció (PCR) 147
A humán mitokondriális DNS és mutációi 149
Missense mutáció 151
Fehérjeszintézis-mutáció 151
Inzerciós-deléciós mutáció 151
Kópiaszám-mutáció 152
Géndeléció kimutatása PCR-rel (41. kísértet) 152
Vírus detektálása PCR-ret 153
Hepatítis B vírus detektálása szérumból (42. kísérlet) 154
VI.Módszertani bemutatók 155
Radioimmuno-assay 155
EnzImimmuno-assay 157
Számítógép a biokémiában 158
Pufferoldatok készítése 162